Index:

1.- Diagnòstic (Dr. Lluis Puig)

2.- Diagnòstic molecular

3.- Las mutacions trobades

4.- Tipus de hemofília
_____________________________

5.- Diagnòtic de portadores (Dr. Eduardo Tizano)

6.- Pot existir una dona afectada per aquest trastorns?

7.- Estudi en ADN

8.- La solució del dilema

Diagnòstic:
Dr. Lluis Puig
Coordinador de l'Unitat d'Hemofilia
Barcelona

Es pot pensar o sospitar en el diagnòstic de hemofília davant malalts amb hemorràgies espontànies o secundàries a traumatismes, especialment si apareixen en les primeres etapes de la vida o en el moment del naixement.

L'avaluació detallada dels antecedents hemorràgics del malalt i de la seva família serà una ajuda important per a orientar el correcte diagnòstic. A continuació és indispensable la participació del laboratori.

En els malalts amb coagulopatíes congénites s'evidencien alteracions en les proves que mesuren globalment la coagulació. Concretament en el cas de la hemofília A i B es troba allargada la proba de la cefalina.

La confirmació del tipus de hemofília s'obté quan es detecta una absència o una disminució significativa del factor VIII (hemofília A) o del factor IX (hemofília B).

2.- Diagnóstico molecular de la hemofilia   

La hemofília es manifesta quan en els gens dels factors VIII o IX es produeixen mutacions, és a dir, alteracions en el DNA que donen lloc a l'absència o pèrdua de funcionalitat de la proteïna.

Ja que els gens constitueixen el material que es transmet de pares a fills, aquestes mutacions, i per tant la malaltia, també són transmeses a la descendència.

El diagnòstic molecular d'una malaltia genètica com la hemofília consisteix en la identificació del defecte o mutació en el gen o bé en la identificació del cromosoma que és portador del gen defectuós.

Això té una repercussió directa ja que possibilita la realització d'un adequat consell genètic i diagnòstic prenatal als membres de la família que així ho sol·licitin.

La identificació del cromosoma portador del gen mutat es realitza mitjançant els estudis de ligamiento: s'utilitzen marcadors polimórficos propers als gens responsables que permeten relacionar un cromosoma determinat de la família estudiada amb la manifestació de la malaltia.

Aquestes tècniques, no obstant això, tenen una sèrie de limitacions que condicionen el seu ús, com poden ser els casos esporàdics, les famílies no informatives per als polimorfismos o l'absència d'almenys un familiar hemofilic viu.

Gràcies als recents avenços en la tecnologia de seqüenciació del DNA, i per a evitar les limitacions intrínseques de l'anàlisi de lligament, s'han dissenyat protocols simplificats per a poder detectar la presència de mutacions en els gens dels factors VIII i IX.

En el cas de la hemofília A existeix una mutació que és molt més freqüent que la resta, és la cridada inversió del intrón 22. Aquesta inversió és responsable del 50% de les hemofílias A severes.

Per tant, un primer pas en el diagnòstic molecular de la hemofília A severa és veure si aquesta inversió és la responsable de la malaltia en la família. Les tècniques emprades per a detectar aquesta mutació no requereixen la seqüenciació i per tant poden ser realitzades de manera més o menys ràpida. La resta de mutacions descrites causants de hemofília A i B inclouen mutacions puntuals, d'eleccions, insercions i estan localitzades al llarg dels gens.

Això obliga a determinar tota la seqüència o composició del gen del factor de coagulació corresponent en el malalt i comparar-la amb una seqüència normal per a identificar les mutacions presents.

3.- Les mutacions trobades:  

Como ja s'ha esmentat, permeten el diagnòstic prenatal i consell genètic adequats, però a més, aquestes mutacions són enviades a bases de dades internacionals conjuntament amb dades clíniques, de manera que constitueixen una font d'estudi que permetrà en el futur introduir millores en les teràpies de substitució amb factors recombinants així com en els assajos de teràpia gènica.

4.- Tipus d'hemofília:
S'han descrit els dèficits congènits de diferents factors de la coagulació (factor II, factor V, factor VII, factor X, fibrinògen), però vam identificar amb el nom de hemofília A la deficiència de factor VIII, i amb el de hemofília B (cridada també malaltia de *Christmas) la de factor IX. La hemofília A és entre 4 i 5 vegades més freqüent que la B.

5.- Diagnóstic de portadores:
         Dr. Eduardo Tizano
         Genética Molecular. Hospital de Sant Pau
         Barcelona. Introducció:

L`anàlisi dels arbres familiars o genealogies en famílies amb afectats d´hemofília A o B va demostrar que aquestes malalties només es manifestaven als homes relacionats per via materna i que, per tant, es tractava d´anomalies que es transmetien lligades al sexe. Resultaven, per tant, malalties hereditàries que es produïen per algún defecte al cromosoma X.

Donat que l´home posseeix un sol cromosoma X, manifesta una malaltia recessiva lligada a la X quan hereta únicament una còpia el gen mutat. La dona, en canvi, per manifestar la malaltia, necessita dues còpies defectuoses, cosa molt poc probable. Per tant, per a aquests transtorns, hi ha famílies d´homes afectats i dones portadores.

Si una dona portadora té fills amb un home no hemofílic, hi ha la probabilitat que la meitat d´homes estaran afectats, ja que tenen el 50% de possibilitats de rebre el cromosoma X sa o el mutat de la seva mare; al mateix moment, en la meitat de les seves filles existeix la probabilitat que siguin portadores (ja que tenen el 50% de probabilitats de rebre el X mutat de la seva mare, però en tots els casos, rebran el X sa del seu pare) i no manifestaran la malaltia però podran transmetre el X mutat als seus fills.

6.- Pot existir una dona afectada per aquest trastorns?  
Aquesta possibilitat estaria donada per la unió d´una dona portadora i un home afectat. Un altre cas seria quan la dona únicament tingués un sol cromosoma X (trastorn conegut com a síndrome Turner). Finalment, com un dels dos cromosomes X s´inactiva a l´atzar, és possible que existís una inactivació majoritària del X sa en alguns teixits, cosa que es manifesta com a malaltia, encara que, en general, de gravetat menor que en els homes.

A les famílies amb afectats d´hemofília és important poder detectar les dones amb risc de ser portadores i, en conseqüència, realitzar l´assessorament genètic corresponent.

En circunstàncies ideals aquest assessorament genètic s´ha de realitzar abans que qualsevol dona amb risc de la família es plantegi tenir descendència.

És molt important quan s´inicia l´estudi dos aspectes bàsics: les dades clíniques i de laboratori que indiquen la gravetat de les manifestacions hemorràgiques en cada pacient i el coneixement que les dones d´una família amb pacients hemofílics són portadores de la malaltia.

L´assessorament genètic no es limita a la menció del risc de transmissió. Abarca tot un procés pel qual és possible assegurar que la família que consulta coneix les implicacions de la malaltia, la manera com s´hereta, la probabilitat que torni a succeir, els factors d´error als calculs de risc i les alternatives que existeixen per a que disposant de tots aquests elements puguin escollir el camí a seguir.

Això implica que l´assessorament genètic ha de ser un procés educatiu e informatiu, però de cap manera impositiu. Un cop plantejat aquest en la família, les dones amb risc de tenir fills afectats que ho vulguin, podran anar als centres especialitzats per tal de determinar el seu estat de portadora o no de la malaltia.

Poden distingir-se dues classes de dones portadores: les portadores obligades són aquelles que són filles d´hemofílic o han tingut un fill hemofílic i existeix o ha existit a la seva família una pacient afectat. La probabilitat de ser portadores és del 100% i el risc per a futurs embarassos és d´un 50% de tenir varons afectats o dones portadores.

Hi ha dones que han tingut més d´un fill hemofílic, però no hi ha altres membres afectats genealògicament relacionats.

Les filles d´una portadora obligada són un exemple de portadores probables: cada una d´elles tenen una probabilitat sobre dos d´haver heretat un cromosoma X anormal, però el seu diagnòstic és sempre una estimació probabilística del seu genotip, basat en l´estudi de la genealogia i en estudis hematològics.

Altre tipus de portadora probable és la mare d´un cas esporàdic, donat que una proporció dels mateixos corresponen a noves mutacions.

En aquesta categoria també s´inclouen a les germanes, filles o altres dones d´ascendència materna. Un cas aïllat d´hemofília pot resultar de la transmissió del gen hemofílic a través de dones, però que no s´ha detectat en la família; d´una nova mutació en la mare, ja sigui ella una portadora o una nova mutació en l´hemofílic.

La detecció de portadores a través d´anàlisi als laboratoris es basa en el fet què aquestes portadores posseeixen el 50% de nivells plasmàtics del Fc VIII o IX, degut al fenomen de Lyó o inactivació a l´atzar del cromosoma X. Donat que aquests factors de la coagulació presenten un ampli rang als valors de normalitat en un bon nombre de portadores, careixen, per tant, de la suficient especificitat i valor diagnòstic per si sols.

Uns raonaments similars poden aplicar-se al diagnòstic bioquímic de les portadores d´hemofília B.

7.- Estudis en ADN:  

Aquests estudis es basen en l´anàlisi molecular del material hereditari o ADN. En el cas de l´hemofília A, l´estudi és específic de la zona del cromosoma X que conté el gen que codifica per al factor VIII.

Donat que el diagnòstic dels afectats d´hemofília A es realitza d´acord amb el nivell d´activitat del factor VIII, des del punt de vista molecular aquesta malaltia s´estudia amb dos objectius:

- diagnòstic, ja sigui de portadores i prenatal
- investigació, relacionada amb la patologia molecular del gen

Un diagnòstic molecular ideal ha d´identificar de manera directa les mutacions que causen la malaltia i fer diagnòstics amb certesa. A les hemofílies, aquestes mutacions són heterogènees en cada afectat i existeix la dificultat per a determinar-les en la seva totalitat.

A la pràctica pot dir-se que cada família té la seva pròpia mutació. Una de les raons d´aquest fet està al tamany del gen del factor VIII, inusualment gran: 186 kilobases o 186.000 parells de bases.

L´anàlisii per polomorfismes (que són variants normals de la seqüència d´ADN que permeten identificar els cromosomes amb la mutació, encara que no la mutació en sí mateixa) constitueix, doncs, un mètode d´elecció alternatiu pel diagnòstic de portadores i diagnòstic prenatal aplicable a la gran majoria de casos d´hemofília, ja siguin familiars o esporàdics.

Els marcadors de l´ADN es poden utilitzar com a sondes per estudiar el patró de segregació anòmal en les famílies amb afectats d´hemofília A. Els mateixos es situen a l´interior del gen del factor VIII (intragènics) o a prop d´ell, al costat de la ubicació del gen del factor VIII al cromosoma X (extragènics).

En els dos casos es tracta d´un anàlisi indirecte del gen anòmal. Aquest mètode, encara que sigui útil, compte amb unes limitacions, com la manca d´informativitat dels marcadors de l´ADN utilitzats en algunes famílies, és a dir, la impossibilitat de determinar quin és el cromosoma X de risc, i la possibilitat de recombinació entre la mutació i els polimorfismes estudiats, la qual cosa fa que els resultats siguin de tipus probabilístic.

Aquestes probabilitats oscil.len del 95 al 99,9% segons si el polimorfisme informatiu és extragènic o intragènic respectivament.

Finalment, existeixen mètodes d´estudi que permeten determinar la mutació al pacient hemofílic i, una vegada identificada aquesta, l´estudi es pot expandir a la resta de familiars. Aquests mètodes, per tractar-se d´un gen tan gran, són laboriosos ja que requereixen l´ànàlisi de moltes regions. Un gen composat per 186.000 parells, el canvi o l´absència d´una sola d´elles és capaç de produir la malaltia.

Hi ha altres canvis d´una sola base que no es manifesten en malaltia (són canvis polimòrfics) i la interpretació dels mateixos ha de ser curadament establerta.

Els mètodes més sofisticats de detecció de mutacions en laboratoris especialitzats van permetre detectar la majoria de les mutacions en hemofílics lleus i moderats, però només la meitat d´hemofílics severs.

8.- La solución del dilema:  
El dilema es va resoldre fa poc amb la descripció d´una inversió de l´intron 22 (que és un sector del gen que no codifica per a la proteina del factor) comú a la meitat dels hemofílics severs. Aquest reordenament de material genètic es pot analitzar comparant el patró de bandes d´individus normals i hemofílics sense inversió amb els dels hemofílics que presenten la inversió.

Les bandes representen fragments del ADN de diferent mida corresponents a la zona del gen del factor VIII. Hi ha un patró normal i altre que presenta aproximadament la meitat dels heofílics severs. Les dones portadores de la inversió tindran un patró de bandes mixte, combinació del cromosoma X amb la inversió i el normal.

A l´hemofília B, encara no s´ha trobat una mutuació freqüent com la inversió de l´hemofília A. Les mutacions en aquest cas són gairebé totes diferents i, encara que el gen és més petit que el del factor VIII, la detecció d´aquestes continua sent laboriosa. En aquest cas, els polimorfismes d´ADN són també útils pel diagnòstic de portadores.

Resposable del Àrea d'informació mèdica:
Dr. Miquel Rutllant Bañeres, nomenat pel Patronat de la FPCH, número de col·legiat 4679, especialitat hematologia i hemoteràpia.