Index:
1.- Diagnóstico (Dr. Lluis Puig)

2.- Diagnóstico molecular

3.- Las mutaciones encontradas

4.- Tipos de hemofilia

5.- Diagnótico de portadoras (Dr. Eduardo Tizano)

6.- ¿Puede existir una mujer afectada por esos trastornos?

7.- Estudio en ADN

8.- La solución del dilema

Diagnóstico:
Dr. Lluis Puig
Coordinador de l'Unitat d'Hemofilia
Barcelona

Se puede pensar o sospechar en el diagnóstico de hemofilia ante enfermos con hemorragias espontáneas o secundarias a traumatismos, especialmente si aparecen en las primeras etapas de la vida o en el momento del nacimiento.

La evaluación detallada de los antecedentes hemorrágicos del enfermo y de su familia será una ayuda importante para orientar el correcto diagnóstico de hemofilia.

A continuación es indispensable la participación del laboratorio. En los enfermos con coagulopatías congénitas se evidencian alteraciones en las pruebas que miden globalmente la coagulación.

Concretamente en el caso de la hemofilia A y B se encuentra alargada la cefalina.

La confirmación del tipo de hemofilia se obtiene cuando se detecta una ausencia o una disminución significativa del factor VIII (hemofilia A) o del factor IX (hemofilia B).

2.- Diagnóstico molecular de la hemofilia

La hemofilia se manifiesta cuando en los genes de los factores VIII o IX se producen mutaciones, es decir, alteraciones en el DNA que dan lugar a la ausencia o pérdida de funcionalidad de la proteína.

Ya que los genes constituyen el material que se transmite de padres a hijos, estas mutaciones, y por lo tanto la enfermedad, también son transmitidas a la descendencia.

El diagnóstico molecular de una enfermedad genética como la hemofilia consiste en la identificación del defecto o mutación en el gen o bien en la identificación del cromosoma que es portador del gen defectuoso.

Esto tiene una repercusión directa ya que posibilita la realización de un adecuado consejo genético y diagnóstico prenatal a los miembros de la familia que así lo soliciten.

La identificación del cromosoma portador del gen mutado se realiza mediante los estudios de ligamiento: se utilizan marcadores polimórficos cercanos a los genes responsables que permiten relacionar un cromosoma determinado de la familia estudiada con la manifestación de la enfermedad.

Estas técnicas, sin embargo, tienen una serie de limitaciones que condicionan su uso, como pueden ser los casos esporádicos, las familias no informativas para los polimorfismos o la ausencia de al menos un familiar hemofílico vivo.

Gracias a los recientes avances en la tecnología de secuenciación del DNA, y para evitar las limitaciones intrínsecas del análisis de ligamiento, se han diseñado protocolos simplificados para poder detectar la presencia de mutaciones en los genes de los factores VIII y IX.

En el caso de la hemofilia A existe una mutación que es mucho más frecuente que el resto, es la llamada inversión del intrón 22. Esta inversión es responsable del 50% de las hemofilias A severas.

Por lo tanto, un primer paso en el diagnóstico molecular de la hemofilia A severa es ver si esta inversión es la responsable de la enfermedad en la familia.

Las técnicas empleadas para detectar esta mutación no requieren la secuenciación y por lo tanto pueden ser realizadas de manera más o menos rápida.

El resto de mutaciones descritas causantes de hemofilia A y B incluyen mutaciones puntuales, delecciones, inserciones y están localizadas a lo largo de los genes.

Esto obliga a determinar toda la secuencia o composición del gen del factor de coagulación correspondiente en el enfermo y compararla con una secuencia normal para identificar las mutaciones presentes.

3.- Las mutaciones encontradas:  
C omo ya se ha mencionado, permiten el diagnóstico prenatal y consejo genético adecuados, pero además, estas mutaciones son enviadas a bases de datos internacionales conjuntamente con datos clínicos, de manera que constituyen una fuente de estudio que permitirá en el futuro introducir mejoras en las terapias de sustitución con factores recombinantes así como en los ensayos de terapia génica.

4.- Tipos de hemofilia:
Se han descrito los déficits congénitos de diferentes factores de la coagulación (factor II, factor V, factor VII, factor X, fibrinógeno), pero identificamos con el nombre de hemofilia A la deficiencia de factor VIII, y con el de hemofilia B (llamada también enfermedad de Christmas) la de factor IX. La hemofilia A es entre 4 y 5 veces más frecuente que la B.


5.- Diagnóstico de portadoras:  
         Dr. Eduardo Tizano
         Genética Molecular. Hospital de Sant Pau
         Barcelona.

Dado que el hombre posee un solo cromosoma X, manifiesta una enfermedad recesiva ligada a la X al heredar una sola copia el gen mutado.

La mujer, en cambio, para manifestar la enfermedad, necesita dos copias defectuosas, cosa muy poco probable. Por lo tanto, para estos trastornos, hay familias de varones afectados y mujeres portadoras.

Si una mujer portadora tiene hijos con un hombre no hemofílico, existe la probabilidad de que la mitad de los varones serán afectados, ya que tienen el 50% de posibilidades de recibir el X sano o el mutado de su madre; a su vez, en la mitad de sus hijas existe la probabilidad de que sean portadoras (ya que tienen el 50% de posibilidades de recibir el X mutado de su madre, pero en todos los casos recibirán el X sano de su padre) y no expresarán la enfermedad, pero podrán transmitir el X mutado a sus hijos.

6.- ¿Puede existir una mujer afectada por esos trastornos?
Esta posibilidad estaría dada por la unión de una mujer portadora y un varón afectado. Otro caso sería la manifestación debido a que la mujer tuviera un solo cromosoma X (trastorno conocido como síndrome Turner).

Finalmente, como uno de los cromosomas X se inactiva al azar, es posible que existiera una inactivación mayoritaria del X sano en algunos tejidos, lo que se manifiesta como enfermedad, aunque, en general, de menor gravedad que en los varones.

En las familias con afectados de hemofilia es importante poder detectar las mujeres con riesgo de ser portadoras y, en consecuencia, realizar el asesoramiento genético correspondiente.

En circunstancias ideales, este asesoramiento genético se debe realizar antes de que cualquier mujer con riesgo de la familia se plantee tener descendencia.

Es esencial en el inicio del estudio y considera dos aspectos básicos: los datos clínicos y de laboratorio que indican la gravedad de las manifestaciones hemorrágicas en cada paciente y el conocimiento de que las mujeres de una familia con pacientes hemofílicos son portadoras de la enfermedad.

El asesoramiento genético no se limita a la mención de un riesgo de recurrencia. Incluye todo un proceso por el cual es posible asegurar que la familia consultante conoce las implicaciones de la enfermedad, la forma cómo se hereda, la probabilidad de que vuelva a suceder, los factores de error en los cálculos de riesgo y las alternativas que existen para que los consultantes, disponiendo de todos estos elementos, puedan elegir el camino a seguir.

Esto implica que el asesoramiento genético debe ser un proceso educativo e informativo, pero de ningún modo impositivo.

Una vez planteado éste en la familia, las mujeres con riesgo de tener hijos infectados que lo requieran concurrirán a los centros especializados a fin de determinar su estado de portadora o no de la enfermedad.

Pueden distinguirse dos tipos de mujeres portadoras: las portadoras obligadas son aquellas que son hijas de hemofílico o han tenido un hijo hemofílico y existe o ha existido en su familia un paciente afectado.

La probabilidad de ser portadoras es del 100% y el riesgo para futuros embarazos es de un 50% de tener varones afectados o mujeres portadoras.

Existen mujeres que han tenido más de un hijo hemofílico, pero no hay otros miembros afectados genealógicamente relacionados.

Las hijas de una portadora obligada son un ejemplo de portadoras probables: cada una de ellas tiene una probabilidad sobre dos de haber heredado un cromosoma X anormal, pero su diagnóstico es siempre una estimación probabilística de su genotipo basada en el estudio de la genealogía y en estudios hematológicos.

Otro tipo de portadoras probables es la madre de un caso esporádico, dado que una proporción de los mismos corresponde a nuevas mutaciones.

En esta categoría también se incluyen a las hermanas, hijas u otras mujeres de ascendencia materna.

Un caso aislado de hemofilia puede resultar de la transmisión del gen hemofílico a través de mujeres, habiendo permanecido sin detectar en la familia; de una mutación en la madre, ya sea ella una portadora o una mutación en el hemofílico.

La detección de portadoras mediante determinaciones analíticas en el laboratorio se basa en el hecho de que las heterocigotas poseen el 50% de niveles plasmáticos del factor VIII o IX, debido al fenómeno de Lyon o inactivación al azar del cromosoma X.

Dado que estos factores de la coagulación presentan un amplio rango en los valores de normalidad en un buen número de portadoras, carecen, por tanto, de la suficiente especificidad y valor diagnóstico por sí solos.

Unos razonamientos similares pueden aplicarse al diagnóstico bioquímico de las portadoras de hemofilia B.

7.- Estudio en ADN:  
Estos estudios se basan en el análisis molecular del material hereditario o ADN. En el caso de la hemofilia A, el estudio es específico de la zona del cromosoma X que contiene el gen que codifica para el factor VIII.

Dado que el diagnóstico de los afectados de hemofilia A se realiza de acuerdo con el nivel de actividad del factor VIII, desde el punto de vista molecular, esta enfermedad se estudia con dos objetivos:
P rimero el de diagnóstico, ya sea de portadoras y prenatal, El segundo de investigación relacionada con la patología molecular del gen.

Un diagnóstico molecular ideal debe identificar en forma directa las mutaciones causantes de la enfermedad y brindar diagnóstico de certeza.

En las hemofilias, estas mutaciones son heterogéneas en cada afectado y existe la dificultad para determinarlas en su totalidad. En la práctica puede decirse que cada familia tiene su propia mutación.

Una de las razones de este hecho radica en el tamaño del gen del factor VIII, inusualmente grande: 186 kilobases o 186.000 pares de bases.

El análisis por polimorfismos (que son variantes normales de la secuencia de ADN que permiten identificar uno u otro cromosoma con la mutación, aunque no la mutación en sí misma) constituye entonces un método alternativo para diagnóstico de portadoras y diagnóstico prenatal aplicable a la gran mayoría de casos de hemofilia, ya sean familiares o esporádicos.

Marcadores del ADN:
Los marcadores del ADN se pueden emplear como sondas para estudiar el patrón de segregación anómalo en las familias con afectados de hemofilia A.

Los mismos se sitúan en el interior del gen del factor VIII (intragénicos) o cerca de él, en la región vecina al lugar de ubicación del gen del Factor VIII en el cromosoma X (extragénicos).

En ambos casos se trata de análisis indirecto del gen anómalo. Este método, si bien útil, cuenta con ciertas limitaciones, como falta de informatividad de los marcadores del ADN utilizados en algunas familias (es decir la imposibilidad de determinar cuál es el cromosoma X de riesgo) y la posibilidad de recombinación entre la mutación y él o los polimorfismos estudiados, lo que hace que los resultados sean de tipo probabilístico.

Estas probabilidades oscilan del 95 al 99.9% según si el polimorfismo informativo es extragénico o intragénico respectivamente.

Finalmente, existen métodos de estudio que permiten determinar la mutación en el paciente hemofílico y, una vez identificada ésta, el estudio puede extenderse al resto de familiares. Estos métodos, al ser un gen tan grande, son laboriosos ya que requieren el análisis de muchas regiones.

En un gen compuesto por 186.000 pares de bases, el cambio o la ausencia de una sola de ellas es capaz de producir la enfermedad.

Hay otros cambios de una sola base que no se manifiestan en enfermedad (son cambios polimórficos) y la interpretación de los mismos debe ser cuidadosamente establecida.

Los más sofisticados métodos de detección de mutaciones en laboratorios especializados permitieron detectar la mayoría de las mutaciones en hemofílicos leves y moderados, pero sólo la mitad de los hemofílicos severos.

8.- La solución del dilema:  
El dilema se resolvió recientemente con la descripción de una inversión del intrón 22 (que es un sector del gen que no codifica para la proteína del factor), común a la mitad de los hemofílicos severos.

Este reordenamiento de material genético se puede analizar comparando el patrón de bandas de individuos normales y hemofílicos sin inversión con el de los hemofílicos que presentan la inversión.

Las bandas representan fragmentos del ADN de distinto tamaño correspondiente a dicha zona del gen del factor VIII. Existe un patrón normal y otro que representa aproximadamente la mitad de los hemofílicos severos.

Las mujeres portadoras de la inversión tendrán un patrón de bandas mixto, combinación del cromosoma X con la inversión y el normal.

En la hemofilia B, aún no se ha hallado una mutación frecuente como la inversión de la hemofilia A.

Las mutaciones en este caso son casi todas diferentes y, aunque el gen es más pequeño que el del factor VIII, la detección de las mismas continúa siendo laboriosa. En este caso, los polimorfismos de ADN son también útiles para el diagnóstico de portadoras.

Resposable del Àrea d'informació mèdica:
Dr. Miquel Rutllant Bañeres, nomenat pel Patronat de la FPCH, número de col·legiat 4679, especialitat hematologia i hemoteràpia.